isolasi sel dendrit

 •       2 tube untuk masing-masing sampel yang akan diuji, 1 tube untuk kontrol negative, 3 tube untuk ST1. Ditambahkan 10µl premixed IC pada setiap tube. Ditambahkan 300µl lysis buffer (hindari kontak ujung pipet dengan ujung tube). Ditambahkan 100µl sampel darah pada tube yang telah ditandai. Jangan memasukkan sampel kedalam tube kontrol.

•       Tube ditutup dan dicampurkan selama 3-5 menit, kemudian diinkubasi kan selama 5 menit dalam suhu 65⁰C, sentrifugasi dengan 13000 rpm selama 30 menit suhu ruang.

•       Ditambahkan 400 µl precipitation buffer ke dalam semua tube, ditutup, dan diaduk selama 3-5 detik. Tube diputar pada 13000 rpm selama 15 menit suhu ruang. Supernatan dibuang dan dihindari kontak antara ujung pipet tip dengan precipitate.

•       Ditambahkan 500 µl washout solution no.1 dan tabung dikocok. Tabung diputar dalam 13000 rpm selama 5 menit suhu ruang. Supernatan dibuang  dan pellet dikeringkan 65⁰C selama 5 menit.

•       Ditambahkan 16.5 µl elution buffer dan kocok 3-5 detik, diinkubasikan selama 10 menit dalam 65⁰C dan diputar 13000 rpm selama 30 detik (DNA-Technology, Research & Production, 2019).

•       RT buffer dan RT sum diambil dan kemudian dihomogenkan dengan vortex dan sentrifuse 1000 rpm selama 3-5 detik. Disiapkan RT mix dengan mencampur RT buffer, RT sum dan reverse transcriptase pada tube plastic terpisah. Ditambahkan 3.5 µl RT mix ke dalam tube dengan sample yang mengandung asam nukleat, pipetting 5-7 kali untuk mencampurnya. Tube diletakkan dalam thermostat dan diincubasikan dalam 40⁰ C selama 30 menit, kemudian 95⁰C selama 5 menit, sentrifugasi pada 13000 rpm selama 30 detik dan cDNA (complementary DNA copy) siap digunakan untuk PCR (DNA-Technology, Research & Production, 2019).

•       PCR buffer dicampurkan dengan TECHNO Taq-polymerase pada suhu ruang selama 3-5 detik. Campuran ini ditambahkan sebanyak 10µl pada tiap tube dan 20µl mineral oil juga ditambahkan pada masing-masing tube, dilakukan vortex selama 3-5 detik , ditambahkan 5.0 µl sampel DNA dan tube ditutup. Tabung diputar selama 1-3 detik. Tabung diatur ke dalam Real-Time PCR Termal Cycler dan software dijalankan (DNA-Technology, Research & Production, 2019).